一些將肽或多肽結合到聚(乙二醇)PEG和類似的水溶性聚(環氧烷)的初始概念公開于美國專利4,179,337中，其公開內容通過引用并入本文中。用這些聚合物改性的多肽顯示出降低的免疫原性/抗原性，并且在血液中循環的時間比未改性的形式更長。

為了結合聚(環氧烷)，將一個羥基末端基團轉化成反應性官能團。該過程常被稱為“活化”，并且該產品被叫做“活化的聚(環氧烷)”。其它基本上非抗原性的聚合物類似地被“活化”或官能化。

將所述活化的聚合物與具有用作連接位點的親核官能團的治療劑反應。通常用作連接位點一個親核官能團為賴氨酸的Ε-氨基。游離羧酸基團、適當地活化的羰基基團、氧化的糖部分和巰基基團也已經用作連接位點。

胰島素和血紅蛋白是其中第一個結合的治療劑。這些相對大的多肽包含數個游離的Ε-氨基連接位點。可連接足夠數量的聚合物以降低免疫原性和增加循環壽命而不顯著喪失生物活性。

然而，過量的聚合物結合和/或涉及治療部分的活性位點的結合，在所述位點中發現與生物活性相關的基團，經常導致喪失活性并因此帶來治療用處。這經常是對于具有較低分子量的肽，常常是這種情況，所述肽幾乎沒有不與生物活性相關的連接位點。許多非肽治療劑還缺乏足夠數量的連接位點以獲得聚合物改性的益處。

克服上述問題的一個建議是使用更長的、更高分子量的聚合物。然而，取決于需要的分子量，這些材料可能難于制備和使用昂貴。另外，它們有時幾乎沒有提供相對于更易獲得的聚合物的改進。

另一個可選的建議是將兩個聚合物鏈通過三嗪環連接于蛋白質的氨基上。參見例如Enzyme，26，49-53(1981)和Proc.Soc.Exper.Biol.Med.，188，364-9(1988)。然而，三嗪是有毒的物質，其在結合后難于降低至可接受的水平。另外，三嗪為平面型基團并僅可被雙聚合物取代。所述平面結構嚴格地將所述兩個聚合物鏈鎖定在位。這將聚合物結合的益處限制到與通過增加聚合物鏈長度而獲得的益處類似相同的程度。因此，基于非三嗪的活化的聚合物將對現有技術提供實質的益處。

然而，在上述情況下，形成的生物活性聚合物共軛物具有在所述聚合物和母體生物活性部分之間基本上耐水解的鍵(鍵合)。因此，制備了永久性連接的長效共軛物，而不是前藥本身(其中母體分子最后在體內被釋放)。

共同轉讓的美國專利5,643,575、5,919,455和6,113,906公開了另外的改進，該改進涉及具有通過脂肪族接頭連接于親核體的共同的點的PEG的多條鏈。與早期的基于三嗪的分支聚合物共軛物不同，所述脂肪族接頭使本領域技術人員避免三嗪的毒性以及提供其它有用的優點。

另外，經過很多年，還已經提出了制備前藥的數種方法。前藥包括生物活性母體化合物的化學衍生物，其在給藥后，將在體內最終釋放所述活性母體化合物。前藥的使用使本領域技術人員可以改變在體內生物活性化合物的作用的開始和/或持續時間。前藥經常是所述母體或活性化合物的生物惰性的或者是基本上失活的形式。所述活性藥物的釋放速率被數個因素影響，所述因素包括將母體生物活性化合物結合于前藥載體的接頭的水解速率。

一些基于酯或磷酸酯鍵合的前藥已經有報道。在大多數情況下，用于形成前藥的酯鍵的具體類型提供對于在水性環境中水解的T1/2為為高達數天。盡管人們期待已經形成了前藥，但大部分所述共軛物在體內完成充分水解之前就被排除了。因此優選提供具有允許所述聚合物-藥物的鍵合在體內更快速水解的鍵的前藥，以更迅速地形成母體藥物化合物。

基于酰胺或氨基甲酸酯鍵合的前藥也已經被報道。通常，酰胺鍵已知具有高度耐水解性。然而，最近已經發現，當用一個或兩個羥基乙基基團將N-端進行N-羥基乙基化時，Ε-氨基酸的C-端酰胺在25℃和PH 7.4下易于水解。雙N-2-羥基乙基甘氨酸(N-二(羥乙基)甘氨酸)型分子對于這樣的水解反應是關鍵的。這樣的N-二(羥乙基)甘氨酸型基團已經被用于合成前藥，參見共同轉讓的美國專利申請10/218,167和10/449,849。

對于在前藥設計的領域中仍有改進的空間。本發明提供這樣的改進。

發明內容

在本發明的一個方面，提供式(I)的化合物

其中R1選自基本上非抗原性的聚合物殘基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基和末端支鏈基團;Z和Z′是相同或不同的，并獨立地選自活性轉運到目標細胞中的部分、疏水部分、雙官能接頭及其組合;Y1-3可以相同或不同，并選自O、S或NR11;L1和L3獨立地為雙官能功能接頭;R3-R11、R24和R25可以相同或不同，并選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代環烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基;L2選自-C(O)(CR30R31)Y15(CR32R33)C(O)NR35-或-C(O)(CR30R31)(CR32R33)C(O)NR35-其中Y15選自O、S、NR34或CH2，和R30-35可以相同或不同，并選自H、烷基、烯基、炔基、雜烷基或芳基;A和A′可以相同或不同，并獨立地選自烷基、離去基團、官能團、診斷試劑、靶向部分、生物活性部分和OH;A、G、E可以相同或不同，并可獨立地為0，或約1至約5的正整數，優選0或1;B、C、D和D′可以相同或不同，并可獨立地為0或1，和M、N、O和P可以相同或不同，并可獨立地為約1至約6的正整數，條件是(A+E)等于或大于1。

本發明的另一個方面包括當R1為包括Α和Ω末端連接基團二者的聚合物殘基時形成的雙官能化合物。在本發明的這個方面中，本領域技術人員能夠將兩個當量的生物活性試劑藥物、蛋白質、多肽、寡核苷酸、診斷試劑等連接于聚合物(優選PEG)的N-二(羥乙基)甘氨酸體系上。這些雙官能聚合物共軛物的例子以下式(II)說明 其中，Z和Z′獨立地為雙官能連接基團或 其中Y4為O、S或NR11并且L5為雙官能接頭，并且所有其它的變量為如上所述的那樣。

還提供制備本發明化合物的方法和利用其進行治療的方法。

為了本發明的目的，術語“殘基”應當被理解為指其所指的化合物的部分，其在經歷取代反應后保留，在所述取代反應中聚合物前藥載體部分已經被連接。

為了本發明的目的，術語“聚合物殘基”或“PEG殘基”應當各自被理解為指聚合物或PEG的部分，該部分在其經歷與生物活性化合物反應后保留。

為了本發明的目的，術語“烷基”應當被理解為包括直鏈的、支鏈的、取代的，例如鹵代-、烷氧基-、硝基-的，C1-12烷基、C3-8環烷基或取代的環烷基，等。

為了本發明的目的，術語“取代的”應當被理解為用一個或多個不同原子加成或替代一個或多個包含于官能團或化合物中的原子。

為了本發明的目的，取代烷基包括羧基烷基、氨基烷基、二烷基氨基、羥基烷基和巰基烷基;取代烯基包括羧基烯基、氨基烯基、二烯基氨基、羥基烯基和巰基烯基;取代的炔基包括羧基炔基、氨基炔基、二炔基氨基、羥基炔基和巰基炔基;取代環烷基包括例如4-氯代環己基的部分;芳基包括例如萘基的部分;取代的芳基包括例如3-溴-苯基的部分;芳基烷基包括如甲苯甲酰基的部分;雜烷基包括如乙基噻吩的部分;取代雜烷基包括如3-甲氧基-噻吩的部分;烷氧基包括如甲氧基的部分;和苯氧基包括如3-硝基苯氧基的部分。鹵代-應當被理解為包括氟代、氯代、碘代和溴代。

為了本發明的目的，術語“足量”應當被理解為達到如本領域普通技術人員理解的效果的治療效果的量。

為了本發明的目的，“有效的非抗原性的”和“基本上非抗原性的”應當被理解為包括所有在本領域中理解為在哺乳動物中基本上無毒的和不引起可感知的免疫應答的聚合物材料。

為了本發明的目的，“正整數”應當被理解為指正的整數，優選約1至6并更優選1或2。

本發明的一個主要優點是N-二(羥乙基)甘氨酸接頭使得可以對前藥的水解速率進行控制，因此在體內以及在體外，在不同的速率下釋放天然實體。例如，多種雙官能部分，包括氨基酸或短肽殘基可被包括作為任何L1-3的部分以調節所述前藥在體內和體外的水解速率和/或細胞吸收等。

本發明的另一個優點是通過將所述聚合物部分連接于所述N-二(羥乙基)甘氨酸體系的僅一個臂上，該結合過程是更純凈的和更快速的。

本發明的另一個優點是由于在水解過程中很少或不形成雜質或副產物而改進了代謝特性。這種不形成雜質還導致更易于純化。

本發明的又一個優點是可以將靶向部分以及生物活性部分，即藥物，兩者都連接于相同的聚合物平臺上，從而增加具有增強的治療有效性的可能性。

本發明的另一個優點是通過這種新型聚合物轉運系統遞送的目標化合物經常證明在水溶解性方面和體內循環壽命方面可測量的增加，尤其在小分子的情況下。

附圖說明

圖1-5示意性說明詳細描述于說明書和實施例中的形成本發明化合物的方法。

本發明的詳細說明A.式(I)在本發明的一個實施方案中，提供式(I)的化合物

其中R1選自基本上非抗原性的聚合物殘基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基和末端支鏈基團;Z和Z′是相同或不同的，并獨立地選自活性轉運到目標細胞中的部分、疏水部分、雙官能接頭及其組合;Y1-3可以相同或不同，并選自O、S或NR11;L1和L3獨立地為雙官能接頭;R3-R11、R24和R25可以相同或不同，并選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代環烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基;L2選自-C(O)(CR30R31)Y15(CR32R33)C(O)NR35-或-C(O)(CR30R31)(CR32R33)C(O)NR35-其中Y15選自O、S、NR34或CH2，和R30-35可以相同或不同，并選自H、烷基、烯基、炔基、雜烷基或芳基;A和A′可以相同或不同，并獨立地選自烷基、離去基團、官能團、診斷試劑、靶向部分、生物活性部分和OH;A、G、E可以相同或不同，并可獨立地為0，或約1至約5的正整數，優選0或1;B、C、D和D′獨立地為0或1，和

M、N、O和P獨立地為正整數，條件是(A+E)等于或大于1。

在本發明某些優選的方面，R1包括基本上非抗原性的聚合物殘基，例如聚乙二醇(PEG)基團。任選地，R1包括在本文命名為J的封端基團。優選的用于聚合物封端的J基團包括如OH、NH2、SH、CO2H的部分，C1-6烷基部分，例如甲基，和式(III)的化合物 其中所有的變量為如上所定義的那樣。

關于包含本發明的化學式的其它變量，下述內容在本發明某些方面中是優選的在某些方面，R1為聚環氧烷殘基，并更優選聚乙二醇殘基;在另一些方面，R1為更詳細描述于下的基于N-二(羥乙基)甘氨酸的末端支鏈基團以允許裝載多個聚合物鏈;在另一個方面，A優選為官能團或生物活性部分，并且A′為官能團、靶向部分或診斷試劑;R3-R11，和R24-25各自為氫，和A、B、C、E、M、N、O和P各自優選為1。

優選地，Z和Z′為如上所述的 或可另選地包含氨基酸殘基，肽殘基，被活性轉運到目標細胞中、疏水的或具有這些性質的組合的基團，使得當與生物活性A基團組合時，形成前藥，其從式(I)和(II)的N-二(羥乙基)甘氨酸聚合物部分釋放。同樣參見共同轉讓的USSN 09/758,993，其內容通過引用并入到本文中。

B.基本上非抗原性的聚合物如上所述，R1優選為水溶性聚合物殘基，該聚合物殘基優選是基本上非抗原性，例如，聚環氧烷(PAO)和更優選為聚乙二醇，例如MPEG。為了說明而非限制的目的，R1的聚乙二醇(PEG)殘基部分可選自J-O-(CH2CH2O)X-，J-O-(CH2CH2O)X-CH2C(O)-O-，J-O-(CH2CH2O)X-CH2CH2NR12-，J-O-(CH2CH2O)X-CH2CH2S-，-OC(O)CH2-O-(CH2CH2O)X-CH2C(O)-O-，-NR12CH2CH2-O-(CH2CH2O)X-CH2CH2NR12-和-SCH2CH2-O-(CH2CH2O)X-CH2CH2S-其中X為聚合程度;R12選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-12支鏈烷基、C3-8環烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代環烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基，和J為關于式II如上所述的封端基團。

在一個特別優選的實施方案中，R1選自CH3-O-(CH2CH2O)X-，CH3-O-(CH2CH2O)X-CH2C(O-O-，CH3-O-(CH2CH2O)X-CH2CH2NH-和CH3-O-(CH2CH2O)X-CH2CH2S-，其中X為正整數，優選選擇使得重均分子量為約2,000至約40,000Da。在本發明可選的方面中，取決于本領域技術人員的需要，所述聚合物的分子量為數百直至40,000或更大。

同樣預計落入本發明的范圍中，R1選自描述于共同轉讓的美國專利5,605,976、5,643,575、5,919,455和6,113,906中的支化的聚合物殘基，每篇專利的公開內容通過引用并入本文中。在這些通式中，優選如下的結構式 其中(Q)為約1至約5的整數;Z″為O、NR13、S、SO或SO2;其中R13為H、C1-8烷基、C1-8支鏈烷基、C1-8取代烷基、芳基或芳烷基;(H)為0或1;(K)為正整數，優選約1至約6。

預計落入本發明范圍內的其它支化活性聚合物優選選自描述于共同轉讓的PCT公開號WO 02/065988和WO 02/066066中的那些化合物，每篇專利的公開內容通過引用并入本文中。在這些通式中，優選如下結構式 其中R1為聚合物殘基，如PEG。

在另一個優選的實施方案中，R1為下式的聚合物殘基 其中R1為聚合物殘基，如PEG;

W為雙官能接頭，如O、氨基酸、 -(CH2)Y、和-NH(CH2CH2O)2-;Z為0、1、2、3或4;N為正整數，優選約1至約500，更優選約200，和Y為正整數，優選約1至約6。

PEG通常由如下結構表示 并且R1′優選包括該式的殘基。

所述聚合物(X)的聚合程度可以為約10至約2,300。其表示在所述聚合物鏈中重復單元的數量并且取決于所述聚合物的分子量。優選地，X為正整數，其被選擇以使得重均分子量為約2,000至約40,000Da。所述(J)部分為如本文中所定義的封端基團，即在所述聚合物的末端出現的基團，在某些方面，可選自NH2、OH、SH、CO2H、C1-6烷基或其它PEG末端活化基團，如本領域技術人員了解的那些基團。

同樣有用的為聚丙二醇，支化的PEG衍生物，如描述于共同轉讓的美國專利5,643,575(′575專利)中的那些，“星形-PEG”和多臂PEG，如描述于Shearwater Corporation的2001年價目表“Polyethylene Glycoland Derivatives For Biomedical Application”中的那些。每篇上述專利的公開內容通過引用并入本文中。由′575專利提供的支化允許從N-二(羥乙基)甘氨酸基團二級或三級支化，以此方式，在生物活性分子或酶上從單個連接點增加聚合物負載。應當理解的是，如果需要，所述水溶性聚合物可被功能化用于連接所述雙官能接頭基團，而無需過度的實驗。

在本發明的大部分方面，盡管PAO和PEG可在重均分子量方面相差很大，但優選R1和R1′可具有重均分子量為約2,000至約40,000Da。

本文中包括的聚合物物質優選為在室溫下是水溶性的。這些聚合物的非限制性的列舉包括聚環氧烷均聚物，如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，聚氧基乙基化的多羥基化合物，其共聚物和其嵌段共聚物，只要保持所述嵌段共聚物的水溶性。

在另外的實施方案中，并且作為對基于PAO的聚合物的備選方案，R1和R1′可任選選自一種或多種有效地非抗原性的材料，如葡聚糖、聚乙烯醇、基于糖的聚合物、羥基丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、聚環氧烷和/或其共聚物。同樣參見共同轉讓的美國專利6,153,655，其內容通過引用并入本文中。本領域普通技術人員可以理解的是如本文中所描述的采用與用于PAO如PEG的相同類型的活化。本領域普通技術人員將進一步意識到上述列舉僅為示例性的并且構思了所有具有本文中描述的品質的聚合物材料，并且還構思了其它聚環氧烷衍生物，如聚丙二醇等。

本發明的聚合物還可與雙官能材料，例如聚(烷撐二醇)二胺共聚以形成穿插的聚合物網絡，其適用于有滲透性的隱形眼鏡、創傷敷料、藥物遞送裝置等。本領域普通技術人員將容易認識到這種支化的位阻限制和水溶性。然而，優選多支化聚合物的分子量不應超過80,000道爾頓。

C.雙官能接頭基團L1、L2、L3和L5在本發明的許多方面，和特別是式(I)中，L1和L3為連接基團，其使得所述N-二(羥乙基)甘氨酸衍生物連接于聚合物鏈或其它部分，例如R1和A′。所提供的鍵可以是，直接的或者通過本領域技術人員已知的另外的結合基團。其它L基團在本說明書中被提及并且它們被理解為選自與L1相同的基團。盡管L2和L5在下文中被進一步描述，但在本發明的一個方面中，L1和L3獨立地選自

-NR19(CR14R15)TO-，-NR19(CR14R15)T(CR16CR17O)SNR19-，-O(CR14R15)TNR19-，-O(CR14R15)TO-，-NR19(CR14R15)TNR19-，-NR19(CR14R15)T(CR16CR17O)S-，-NR19(CR16CR17O)T-，-NR19(CR16CR17O)T(CR14R15)SNR19-，-NR19(CR16CR17O)T-，-O(CR14R15)T-NR19-，-O(CR14R15)TNR19-，-O(CR14R15)TO-，-O(CR16CR17O)TNR19-， 其中R14-R17和R19獨立地選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代環烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基;和R18選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代環烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基、NO2、鹵代烷基和鹵素;和T和S為獨立地選擇的正整數，優選約1至約4。

在本發明的另一些方面，L1和L3可包括氨基酸殘基。所述氨基酸可選自任何已知的天然存在的L-氨基酸，例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、脯氨酸和/或其組合，僅以這些為例。當L1包括肽時，所述肽大小不同，例如，約2至約10個氨基酸殘基。在一個優選的實施方案中，所述肽為Gly-Phe-Leu-Gly。

所述氨基酸殘基優選為下式 其中X′為O、S或NR26，Y5為O、S或NR27，并且R26、R27和R28獨立地選自與定義R3相同的基團，但各自優選為H或低級烷基(即C1-6烷基);并且F為約1至約10的正整數，優選1。

天然存在的氨基酸的衍生物和類似物，以及多種本領域已知的非天然存在的氨基酸(D或L)，疏水的或非疏水的，同樣落入到本發明的范圍內。僅僅舉例來說，氨基酸類似物和衍生物包括2-氨基己二酸、3-氨基-己二酸、Β-丙氨酸、Β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-氨基丁酸、鎖鏈賴氨素、2，2-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基-甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈賴氨素、別-異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基異亮氨酸、6-N-甲基-賴氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸和其它太多以致不能提及的，它們列舉于63 Fed.Reg.，29620，29622中，其通過引用并入本文中。

短肽為例如得自如前所述的2至約10或更多個氨基酸殘基的肽。

更優選地，L1和L3獨立地選自

-NH(CH2CH2)2O-，-NH(CH2CH2)(CH2CH2O)NH-，-O(CH2CH2)NH-，-O(CH2CH2)O-，-NH(CH2CH2)NH-，-NH(CH2CH2)(CH2CH2O)-，-NH(CH2CH2O)-，-NH(CH2CH2O)(CH2)NH-，-NH(CH2CH2O)2-，-O(CH2)3NH-，-O(CH2)3O-，-O(CH2CH2O)2NH-。

在本發明的另一個實施方案中，L2選自-C(O)CR30R31OCR32R33C(O)NR35-;-C(O)CR30R31NR34CR32R33C(O)NR35-;-C(O)CR30R31SCR32R33C(O)NR35-，或-C(O)(CR30R31)NC(O)NR35-;其中R30-35獨立地選自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6雜烷基或芳基，和N為正整數，優選約1至約3。

優選地，L2選自-C(O)CH2OCH2C(O)NH-;-C(O)CH2NHCH2C(O)NH-;-C(O)CH2SCH2C(O)NH-;-C(O)CH2CH2CH2C(O)NH-，或-C(O)CH2CH2C(O)NH-.。

本發明的主要的優點為本領域技術人員可控制水解的速率或生物活性部分或藥物從所述聚合物N-二(羥乙基)甘氨酸平臺上的釋放速率。取決于選擇的特定接頭，本領域普通技術人員可將所述化合物改性以控制水解速率。本發明該優選的方面允許本領域技術人員調節所述生物活性物質遞送到希望的目標的速率。在需要所述生物活性部分或藥物的快速釋放的情況下，L2接頭的并入提供增強的水解速率。相反，對于公開于共同轉讓的美國專利申請10/218,167中的早期基于N-二(羥乙基)甘氨酸的聚合物平臺，其中所述部分或藥物從所述平臺的釋放經常依賴于例如PH或酶的存在的條件，所述接頭L2由于鄰位協助，能夠顯著增強所述生物活性部分或藥物從所述聚合物平臺釋放，而不依賴于PH條件或在酶存在或不存在的條件。然而，在酶存在下，水解的速率將或者通過如果可適用的鄰助作用，或者通過酶反應，而控制，選擇其中更快的一種。因此，水解的速率高度依賴于在所述N-二(羥乙基)甘氨酸部分本身和所述PEG部分之間所用的接頭的類型。

D.Z和Z′部分和它們的功能在本發明的一個方面，Z和Z′為L5-C(=Y4)，其中L5為雙官能接頭并選自與L1相同的基團，并且Y4選自與Y1-3定義相同的基團。在本發明的這個方面，Z和Z′基團用作在A基團和所述N-二(羥乙基)甘氨酸轉運形式的剩余部分之間的連接。

在本發明的其它方面，Z和Z′基團為被活性轉運到目標細胞中的部分，疏水部分，及其組合。盡管Z和Z′優選為單價的，但它們可任選為二價或多價的以使得多于一個A基團連接于基于N-二(羥乙基)甘氨酸的聚合物。為了獲得所述活性轉運，Z和Z′可包括氨基酸、肽殘基或聚胺殘基，例如任何上述關于L1的那些、糖殘基、脂肪酸殘基、C6-18烷基、取代芳基、雜芳基、-C(=O)、-C(=S)或-C(=NR29)，其中R29為H、低級烷基等。

本發明的這個方面廣泛基于這樣的原理適合于并入到基于N-二(羥乙基)甘氨酸-聚合物的前藥共軛物的生物活性材料自身可以是在從N-二(羥乙基)甘氨酸連接的組合物中水解釋放后沒有活性物質/化合物，但其在經歷進一步化學過程/反應后將變得有活性。在本實施方案中，通過基于N-二(羥乙基)甘氨酸的聚合物體系遞送到血流中的治療或診斷試劑、肽、多肽等，將保持沒有活性直至進入或被活性轉運到感興趣的目標細胞中，在那里，其通過細胞內化學，例如通過存在于組織或細胞中的酶或酶體系，而活化。

制備本發明的這個方面的前藥以使得所述基于N-二(羥乙基)甘氨酸-聚合物的共軛物的體內水解切斷所述共軛物以將所述活性生物材料(本文中命名為A)釋放到細胞外液中，同時仍連接于Z或Z′部分。在本發明的該方面中的生物活性材料優選，但不排它地，為小分子治療劑和/或診斷劑。例如，一個潛在地Z-A組合為亮氨酸-阿霉素，另一個為氨基酸連接的喜樹堿或紫杉醇，并且待被治療的組織為腫瘤組織。

關于本發明如何操作，不意于被任何理論或假設束縛，據信，取決于選擇為轉運增強劑的另外的部分，生物活性材料轉運到腫瘤細胞中的速率為通過生物活性材料以被保護的和/或轉運增強的形式遞送到細胞外組織空間，例如顯示出EPR效應的組織。

在另一個選擇中，轉運增強劑(Z或Z′)選自用于細胞膜轉運體系的已知底物。僅僅舉例說明，已知細胞活性轉運某些營養物質和內分泌因子等，并且這些營養物質，或其類似物，易于被用于增強生物有效物質活性轉運進入目標細胞。這些營養物質的例子包括氨基酸殘基、肽，例如大小為約2至約10或更多個殘基的短肽、簡單的糖和脂肪酸、內分泌因子等。

短肽為，例如，如前所述的范圍為2至約10或更多個氨基酸殘基的肽。在本發明的實施方案中，據信這些肽轉運增強劑不需要是疏水的，而是被認為以其它途徑起作用以增強吸收和/或保護所連接的小分子試劑，使其不會在通常的血流中過早水解。例如，肽轉運增強劑，如聚精氨酸和其它類似分子量范圍的轉運增強劑，被認為立體阻礙了通過基于血漿的水解酶切斷生物活性試劑，但然后在目標細胞內被多種肽和/或蛋白酶，例如組織蛋白酶切斷。

在某些優選的方面中，Z和Z′為疏水性部分。關于疏水性如何貢獻于效力，不意于限制于任何理論和假說，據信疏水部分通過抑制存在于細胞外組織空間，例如在血漿中的水解酶等的攻擊而抑制了從所述活性生物試劑上細胞外切離所述轉運增強劑。因此，一些優選的轉運增強劑包括例如如上所述的疏水氨基酸，如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，以及非天然存在的衍生物，如，Γ-氨基酸及其類似物，如上文所述。

在另一選擇中，所述轉運增強劑為疏水有機部分。僅僅舉例說明，所述有機部分為取代或未取代的C6-18或更大的烷基、芳基或雜芳基。所述有機部分轉運增強劑還預計包含和包括有機官能團，該有機官能團包括例如-C(=S)和/或-C(=O)。

E.式(I)A、A′和D基團1.離去或活化基團在其中A和A′未離去或活化基團的那些方面，合適的部分包括但不限于，例如N-羥基苯并三唑基、鹵素、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺基、對硝基苯氧基、咪唑基、N-羥基琥珀酰亞胺基的基團;噻唑烷基硫酮、O-酰基脲、五氟苯氧基、2，4，6-三氯苯氧基或其它合適的對于本領域普通技術人員顯而易見的離去基團。

為了本發明的目的，離去基團應被理解為能夠與親核體反應的那些基團，其中所述親核體可在需要的目標上發現，即在生物活性部分、診斷試劑、靶向部分、雙官能間隔部分、中間體等。所述目標因此包含用于置換的基團，例如發現于蛋白質、肽、酶、天然或化學合成的治療分子如阿霉素、間隔部分如單保護的二胺上發現的NH2基團。

如果需要，本發明的化合物還可以包括在N-二(羥乙基)甘氨酸基團和離去基團或連接的目標(藥物)之間的間隔基團。所述間隔部分可以是包含高達18個碳原子和甚至另外的聚合物鏈的雜烷基、烷氧基、烷基。所述間隔部分可利用標準合成技術加入。應當理解，那些選擇用于A和A′的部分還可與除了生物活性親核體外的其它部分反應。

2.官能團A和A′還可以是官能團。這些官能團的非限制的例子包括馬來酰亞胺基、乙烯基、砜的殘基、羥基、氨基、羧基、巰基、酰肼、肼基甲酸酯等，它們通過包含胺的間隔部分連接于N-二(羥乙基)甘氨酸部分。一旦連接于所述N-二(羥乙基)甘氨酸部分，所述官能團(例如馬來酰亞胺)，可用于將所述N-二(羥乙基)甘氨酸聚合物連接于目標，如多肽、氨基酸和肽間隔部分等的半胱氨酸殘基。

3.生物活性部分在其中A和A′為含有胺和羥基的化合物的殘基的式(I)的那些方面。這些合適化合物的非限制性列舉包括有機化合物、酶、蛋白質、多肽等的殘基。有機化合物包括但不限于，例如包括柔紅霉素、阿霉素的蒽環類化合物的部分;對氨基苯胺芥子氣、美法侖、Ara-C(胞嘧啶阿拉伯糖苷)和相關抗代謝性藥物化合物，例如吉西他賓等。或者，所述部分可以是含胺或含羥基的下列殘基心血管劑、抗瘤的試劑例如喜樹堿和紫杉醇，抗感染藥，抗真菌藥如制霉菌素、氟康唑和兩性霉素B，抗焦慮劑，胃腸劑，中樞神經系統激活劑，鎮痛藥，致育劑，避孕劑，抗炎劑，甾族劑，試劑等。

除了上述物質，所述生物活性部分還可以是酶，蛋白質，多肽，單克隆抗體，免疫結合物的殘基，例如，SS1P，單鏈抗原結合蛋白(SCA)，例如，CC49，和其片段也是預計包含在本發明中的。合適的蛋白質包括但不限于，具有至少一個適用于聚合物連接的基團，例如Ε-氨基、胱氨酸酰硫基(Cystinylthio)、N末端氨基的多肽、酶、肽等，包括具有生理或藥理活性的材料，以及那些能夠催化在有機溶劑中的反應的那些。

感興趣的蛋白質、多肽和肽包括，但不限于血紅蛋白、血清蛋白，例如包括因子VII、VIII和IX的血液因子;免疫球蛋白，細胞因子，例如白介素，即IL-1至IL-13等，Α，Β和Γ干擾素，包括粒細胞集落刺激因子的集落刺激因子，得自血小板的生長因子和磷脂酶活化蛋白質(PLAP)以及胸腺素Α1和腸促胰液肽。具有通常的生物或治療興趣的其它蛋白質包括胰島素，植物蛋白質，例如外源凝集素和蓖麻子白蛋白，腫瘤壞死因子和相關的蛋白質，生長因子例如轉化生長因子，例如TGF″Α或TGF$Β和表皮生長因子，激素，生長調節素，紅細胞生成素，色素激素，下丘腦釋放因子，抗利尿激素，促乳素，絨膜促性腺激素，促卵泡激素，甲狀腺促進激素，組織纖溶酶原激活劑，等。感興趣的免疫球蛋白類包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段。

一些蛋白質，例如白細胞介素，干擾素和集落刺激因子，通常作為采用重組技術的結果還以非糖基化形式存在。所述非糖基化形式也在本發明的蛋白質中。

感興趣的酶包括碳水化合物特異性酶，蛋白水解酶，氧化還原酶，轉移酶，水解酶，裂解酶，異構酶和連接酶。不限制于特定的酶，感興趣的酶的例子包括天冬酰胺酶，精氨酸酶，精氨酸脫氨酶，腺苷脫氨酶，超氧化物岐化酶，內毒素酶，過氧化氫酶，糜蛋白酶，脂肪酶，尿酸酶，腺苷二磷酸酶，酪氨酸酶和膽紅素氧化酶。感興趣的碳水化合物特異性酶包括葡萄糖氧化酶，Glucodases，半乳糖苷酶，葡糖腦苷脂酶，Glucouronidases，等。

本文中還包括說明體內生物活性的生物聚合物的任何部分。這包括氨基酸序列，核酸(DNA，RNA)，肽核酸(PNA)，抗體片段，單鏈結合蛋白，參見，例如美國專利4,946,778，其公開的內容通過引用并入本文中，結合分子包括抗體或片段，多克隆抗體，單克隆坑體和催化抗體的融合。

所述蛋白或其部分可通過使用本領域技術人員已知的技術制備或分離，所述技術為組織培養，從動物來源提取，或通過重組DNA方法。蛋白質，多肽，氨基酸序列等的轉基因源也預計落入本發明中。這些材料得自轉基因動物，即，小鼠、豬、牛等，其中所述蛋白質在奶、血或組織中表達。轉基因昆蟲和桿狀病毒表達體系也預計用作來源。另外，蛋白質的突變體形式，例如突變的干擾素也落入本發明的范圍內。

感興趣的其它蛋白質為變應源蛋白質，例如豚草，抗原E，蜂毒，螨變應源，等。上述為適合于本發明的蛋白質的例舉。應當理解如本文中所定義的，沒有明且提及但具有可用的氨基的那些蛋白質，也屬于本發明的范圍內。

在本發明優選的方面，所述含氨基或羥基的化合物為適用于醫學或診斷用于治療動物的生物活性化合物，所述動物為包括人的哺乳動物，用于需要這種治療的癥狀。上述列舉意于舉例說明而非限制可被修飾的化合物。本領域普通技術人員將意識到其它這樣的化合物/組合物可被類似地改性而無需過度的實驗。應當理解，沒有明確提及但具有適當的結合基團的那些生物活性材料也意于和在本發明的范圍內。

對適合于包含于本文中的包含氨基或羥基的分子的類型的唯一的限制是要有至少一個胺(伯胺或仲胺)或羥基，其可與聚合物共軛物反應和連接，并且在所述前藥體系釋放和再次產生母體化合物后，基本上不會喪失生物活性。

4.烷基在其中A和A′為烷基的式(I)的那些方面，適當的基團的非限制性的列舉由C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代環烷基、芳烷基、C1-6雜烷基和取代的C1-6雜烷基組成。

5.診斷試劑在其中A和A′為診斷試劑的式(I)的那些方面，適當的試劑的非限制性列舉包括染料，螯合劑，和同位素標記化合物和其它標記化合物，例如綠熒光蛋白(GFP)。

6.靶向部分在其中A和A′為靶向部分的式(I)的那些方面，適當的試劑的非限制性列舉包括肽如TAT肽和U-7肽，單鏈抗體如CC49，和小分子如牛磺酸和生物素。

F.N-二(羥乙基)甘氨酸連接的聚合物的合成具體的基于N-二(羥乙基)甘氨酸的聚合物的化合物的合成在實施例中闡明。為了說明的目的，現在轉向圖1，一個優選的方法包括1)將約一當量的擴展封閉的雙官能接頭，例如， 與約一當量的酸保護的N-二(羥乙基)甘氨酸部分(在圖1中確定為1)反應以形成中間體，例如 其中TBu為保護基團;2)將步驟1)的中間體與酰化試劑，例如乙酰氯反應以形成中間體，例如，

3)將形成的上述中間體解除封閉，并使其與活化的聚合物，例如PNP-PEG和SC-PEG在堿性偶合條件下反應，4)將所述N-二(羥乙基)甘氨酸脫保護，并在之后將該酸用適當的活化基團，例如噻唑烷基硫酮或N-羥基琥珀酰亞胺，在偶合條件下活化。

用于制備所述N-二(羥乙基)甘氨酸衍生物的另選的方法包括1)將一當量的擴展封閉的雙官能接頭與一當量的酸保護的N-二(羥乙基)甘氨酸部分反應以形成中間體，例如 其中TBu為保護基團;2)將得自步驟1)的中間體與適當改性的活化基團，例如 反應以形成中間體，例如

3)將形成的上述中間體解除封閉，并使其與活化的聚合物，例如PNP-PEG和SC-PEG在堿性偶合條件下反應，和4)將所述N-二(羥乙基)甘氨酸脫保護，并在之后用適當的活化基團，例如噻唑烷基硫酮和N-羥基琥珀酰亞胺，在偶合條件下活化。

應當理解的是，其它的本領域公認的保護基團可用于替代T-Bu。現在，活化的PEG或聚合物N-二(羥乙基)甘氨酸衍生物能夠與藥物、肽、間隔部分反應和與之結合。

適當的偶聯劑的非限制性的列舉包括1，3-二異丙基-碳二亞胺(DIPC)，任何合適的二烷基碳二亞胺，2-鹵代-1-烷基吡啶鎓鹵化物(Mukaiyama試劑)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，丙烷膦酸環狀酸酐(PPACA)和二氯磷酸苯酯等。它們可商購于例如Sigma-Aldrich Chemical，或利用已知的技術合成。

優選地，所述取代基在惰性溶劑中反應，所述惰性溶劑例如四氫呋喃(THF)、乙腈(CH3CN)、二氯甲烷(DCM)、氯仿(CHCl3)、二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物。合適的堿包括二甲基氨基吡啶(DMAP)，二異丙基乙胺、吡啶、三乙胺、KOH、叔丁醇鉀和NaOH等。所述反應通常在約0℃直至約22℃(室溫)的溫度下進行。

無論所選擇的途徑如何，由本文中所述的合成技術形成的一些優選的化合物包括

其中A1為例如以下的

的基團或其它離去基團或活化基團，例如如上所述的那些。

所述N-二(羥乙基)甘氨酸活化的聚合物與適當的目標反應，導致該活性聚合物轉化成共軛物，將A1轉化為A2，其中A2為生物活性部分、間隔部分等的殘基。

由如上本文中描述的技術導致的優選化合物的非限制性列舉為

其中

G.多個聚合物的負載在本發明的又一個方面中，提供基于N-二(羥乙基)甘氨酸的多支化的聚合物化合物。具體而言，所述堿性N-二(羥乙基)甘氨酸衍生物被進一步改性以包括一個或多個末端支化基團。優選地，所述末端支化基團為下式 其中Y6和Y7獨立地為O、S或NR46;L6為選自與L1相同定義的雙官能接頭;L8為選自與L2相同定義的雙官能接頭;R40-R46可以相同或不同，并選自氫、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支鏈烷基、C3-8環烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代環烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6雜烷基、取代的C1-6雜烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6雜烷氧基;J、J′、I和I′各自獨立地為0或正整數;L和L′獨立地為0或1;U、R、V和W為獨立選擇的正整數;R50選自基本上非抗原性的聚合物殘基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基，和

其中L7為選自與L1相同定義的雙官能接頭;L9為選自與L2相同定義的雙官能接頭;R60選自基本上非抗原性的聚合物殘基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、芳烷基，并且所有其它的變量為如上所定義的。

所形成的支化N-二(羥乙基)甘氨酸衍生物為下式結構

其中所有變量為如上所定義的。

如上和在實施例中所述的，利用本發明的方法所形成的N-二(羥乙基)甘氨酸聚合物體系提供用于多重負載生物活性部分或其它A基團的能力。本發明的該支化的N-二(羥乙基)甘氨酸體系的優點為本領域技術人員可采用線性高分子量聚合物和另外，以根據本領域技術人員的需要連接一個或多個生物活性部分、診斷試劑或靶向試劑的多種組合。

H.體內診斷本發明的另一個方面提供本發明的共軛物，其任選用連接于如上所述的轉運增強劑的診斷標記制備，其中該標記被選擇以用于診斷或成像目的。因此，通過將任何合適的部分，例如氨基酸殘基，連接于任何本領域標準的放射性同位素、輻射透不過的標記物、磁共振標記物或其它適合于磁共振成象的非輻射活性的同位素標記物，熒光型標記物，顯示出可見色彩和/或能夠在紫外、紅外或電化學刺激下發出熒光的標記物，以使得腫瘤組織在外科過程中成像，等。任選地，將所述診斷標記并入到和/或連接于結合的治療部分中，使得可以監控在動物或人類患者中的治療性生物活性材料的分布。

在本發明的又一個方面，本發明的附屬的共軛物通過已知的方法，利用任何適合的標記物，包括例如放射性同位素標記物而容易地制備。僅僅舉例說明，這些包括131碘、125碘、99m锝和/或111銦以產生用于在體內選擇性吸收進入腫瘤細胞的放射免疫閃爍顯像試劑。例如，有很多本領域已知的將肽連接于Tc-99m的方法，其包括僅僅舉例說明，美國專利5,328,679、5,888,474、5,997,844和5,997,845中說明的那些，這些文獻通過引用并入本文中。

廣泛地，為了在解剖學上定位在患者中的腫瘤組織，將所述結合的附屬物給藥到懷疑具有腫瘤的患者或動物中。在充足的時間使標記的免疫球蛋白在一個或多個腫瘤位點處定位后，通過X-射線照相術，計算機化橫面X線斷層攝影術，MRI，通過熒光標記的儀器檢測，通過照片掃描裝置，例如Γ照相機，或適用于所選擇的標記的性質的其它方法或儀器而例如，可見地檢測由標記物產生的信號。

然后將所檢測的信號轉化成圖象或腫瘤位置的解剖學和/或生理學確定。該圖象使得其可能在體內定位所述腫瘤并設計出合適的治療方案。在其中標記的部分自身就是治療劑的那些實施方案中，所檢測的信號在治療過程中提供解剖學定位的證據，提供用于隨訪診斷和治療干預的基準。

I.治療方法本發明的另一個方面提供在哺乳動物中對于多種醫學狀況的治療方法。所述方法包括向需要這種治療的哺乳動物給藥有效量的前藥，例如阿霉素-N-二(羥乙基)甘氨酸結合的PEG共軛物，其已經如本文所述的那樣被制備。所述組合物尤其用于在哺乳動物中治療瘤性疾病，降低腫瘤負擔，防止腫瘤轉移和防止腫瘤/瘤生長的復發。

所給藥的前藥的量取決于包括于其中的母體分子，例如肽，多肽，蛋白質，酶等。通常，用于所述治療方法的前藥的量為在哺乳動物中有效獲得希望的治療結果的量。自然地，不同前藥化合物的劑量將取決于所述母體化合物、體內水解的速率、所述聚合物的分子量等而在一定程度上變化。本領域技術人員將確定基于臨床經驗和治療適應癥而選擇的前藥的最佳劑量。實際的劑量對于本領域技術人員而言將是顯而易見的而無需過度的實驗。

本發明的組合物可被包括于一個或多個適合用于向哺乳動物給藥的藥物組合物中。所述藥物組合物可以是溶液、懸浮液、片劑、膠囊等的形式，其根據本領域公知的方法制備。還預計這些組合物的給藥可以通過口服和/或非腸道途徑，這取決于本領域技術人員的需要。所述組合物的溶液和/或懸浮液可用作例如用于通過任何本領域已知的方法注射或滲透所述組合物的載體媒介物，所述方法例如通過靜脈內、肌內、皮下注射等。

這種給藥還可通過灌注進入身體空間或腔，以及通過吸入和/或鼻內途徑。然而，在本發明優選的方面中，將所述前藥非經腸道地給藥到需要其的哺乳動物中。

實施例如下實施例提供本發明的進一步說明，但不意于以任何方式限制本發明的有效范圍。在實施例中的下劃線和粗體數字對應于示于圖1至5中的那些。

化學通用步驟。所有的反應在干燥氮氣或氬氣的氣氛下進行。使用市售的試劑而不用進一步純化。將所有的PEG化合物在使用前在真空下干燥或通過從甲苯中共沸蒸餾而干燥。NMR光譜，除非另外說明，是利用Varian Mercury300 NMR光譜儀和氘代氯仿作為溶劑而獲得的。化學位移(Δ)以從四甲基硅烷(TMS)的低磁場的百萬比率(Ppm)報告。

HPLC法。反應混合物，以及中間體和終產物的純度通過BeckmanCoulter System GoldHPLC儀器進行監控，所述儀器采用ZOBAX300SB C-8反相柱(150×4.6mm)或Phenomenex Jupiter300A C18反相柱(150×4.6mm)，采用多波長UV檢測器，采用在0.5%三氟乙酸(TFA)中的30-90%乙腈的梯度，流速為1mL/Min。

實施例1化合物3的合成將2(2.3g，8.7mmol)、1(1.9g，8.8mmol)和DMAP(1.6g，12.9mmol)的30ml無水二氯甲烷的溶液在冰浴中冷卻至0℃，隨后加入EDC的鹽酸鹽(2.3g，12.0mmol)。將該混合物溫熱至室溫過夜，隨后用0.1N的HCl洗滌。將有機相經無水硫酸鈉干燥，過濾，并將溶劑通過旋轉蒸發從濾液中除去以生成3(3.6g，7.8mmol，90%)。13CNMR(75.4MHz，CDCl3)Δ170.04，169.86，155.54，80.87，78.66，70.49，69.95，68.14，62.71，55.85，52.59，40.02，28.15，27.91。

實施例2化合物4的合成向3(1.8g，3.9mmol)的35ml無水二氯甲烷溶液中加入乙酰氯(0.49g，6.2mmol)，隨后加入二異丙基乙基胺(1.82g，14mmol)。將該混合物在室溫下攪拌10分鐘，此時通過TLC檢測不到原料。將該混合物用飽和碳酸氫鈉洗滌并經無水硫酸鈉干燥，過濾，并將溶劑通過旋轉蒸發從濾液中除去以生成1.6g的粗產物。將該材料通過在硅膠上的柱色譜法純化，并用2.5%乙腈的乙酸乙酯洗脫以生成4(0.69g，1.4mmol，35%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ170.60，170.27，170.02，155.68，80.99，78.88，70.68，70.13，70.10，68.34，62.93，62.74，56.11，52.81，52.76，40.21，28.29，28.08，20.88。

實施例3化合物7的合成將在20ml二氯甲烷和5ml的TFA中的4(0.25g，0.50mmol)的溶液在室溫下攪拌15分鐘，隨后通過旋轉蒸發從濾液中除去溶劑以生成5。將化合物5與10ml無水二氯甲烷合并，隨后加入DIEA直至PH大于8.0(～0.2g)。將該N-二(羥乙基)甘氨酸溶液加入到6(5.0g，0.12mmol)的40ml無水二氯甲烷溶液中，并在室溫下攪拌過夜。此時，通過旋轉蒸發將溶劑部分除去，用醚沉淀產物，并收集并用醚洗滌。將該粗產物從12%DMF/IPA中重結晶以生成7(4.6g，0.11mmol，90%)。

13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ170.31，170.03，169.76，155.91，80.74，70.64-70.19(PEG)，69.78，69.72，69.23，68.13，63.52，62.73，62.53，55.92，52.64，40.46，27.91，20.69.

實施例4化合物8的合成將在50ml二氯甲烷和25ml的TFA中的7(4.8g，0.12mmol)的溶液在室溫下攪拌7小時，隨后通過旋轉蒸發將溶劑部分除去，并用醚使產物沉淀。通過過濾收集固體，并用醚洗滌數次并干燥以生成8(4.1g，0.10mmol，85%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ171.15，170.25，169.71，155.96，70.19-69.77(PEG)，69.22，69.16，63.51，62.29，61.94，55.77，53.11，53.01，40.44，20.60。

實施例5化合物9的合成將8(4.0g，0.1mmol)，2-巰基噻唑啉(70mg，0.59mmol)和DMAP(0.1g，0.79mmol)的40ml無水二氯甲烷的溶液在冰浴中冷卻至0℃，隨后加入EDC的鹽酸鹽(0.11g，0.59mmol)。將該混合物溫熱至室溫過夜。此時，通過旋轉蒸發將溶劑部分除去，將產物用醚沉淀，并收集并用醚洗滌。將粗產物從12%DMF/IPA中重結晶以生成9(3.7g，0.09mmol，93%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ200.96，172.78，170.35，169.80，155.93，70.70-70.21(PEG)，69.81，69.75，69.25，68.13，63.57，63.03，62.77，60.64，55.34，52.64，40.49，28.80，20.72。

實施例6化合物10的合成將在30ml二氯甲烷和30ml DMF的9(3.0g，0.073mmol)，阿霉素(0.17g，0.29mmol)和DMAP(71mg，0.59mmol)的溶液在室溫下攪拌過夜。此時通過旋轉蒸發將溶劑部分除去，將產物用醚沉淀，并收集并用醚洗滌。將粗產物從DMF/IPA中重結晶三次以生成10(2.9g，0.069mmol，94%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ211.24，186.23，185.89，170.47，169.82，169.04，161.81，160.34，155.78，155.14，135.20，134.79，133.84，133.58，120.16，119.13，118.01，110.76，110.60，100.34，72.19-67.95(PEG)，66.87，63.31，61.75，61.45，58.97，56.21，53.83，44.44，40.29，36.03，34.67，32.83，30.97，29.38，24.97，24.45，20.54，16.46。

實施例7化合物13的合成將12(2.5g，10.1mmol)，二乙醇酸酐11(1.1g，9.5mmol)和DMAP(1.3g，9.5mmol)的25ml二氯甲烷溶液在室溫下攪拌過夜，隨后用0.2N HCl洗滌。將有機相經無水硫酸鈉干燥，過濾，并通過旋轉蒸發將溶劑從濾液中除去以生成13(2.9g，8.0mmol，84%)。Nmr顯示峰成雙。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ172.92，171.14，169.92，169.58，157.50，155.79，80.86，79.03，71.34，70.69，70.19，70.06，69.84，69.64，69.33，69.15，68.85，68.40，53.29，41.37，36.97，38.75，38.55，28.10。

實施例8化合物14的合成將13(2.8g，7.7mmol)，1(1.7g，7.7mmol)和DMAP(1.3g，10.8mmol)的30ml無水二氯甲烷溶液在冰浴中冷卻至0℃，隨后加入EDC鹽酸鹽1.9g(10.0mmol)。將該混合物溫熱至室溫過夜，隨后用0.2NHCl洗滌。將該有機相經無水硫酸鈉干燥，過濾，并通過旋轉蒸發將溶劑從濾液中除去以生成14(2.3g，4.1mmol，53%)。

實施例9

化合物15的合成向粗制14(2.3g，4.1mmol)的20ml無水二氯甲烷溶液中加入乙酰氯(0.64g，8.2mmol)，隨后加入二異丙基乙基胺(1.1g，8.2mmol)。將該混合物在室溫下攪拌10分鐘，此時通過TLC檢測不到原料。將該混合物用飽和碳酸氫鈉洗滌并經無水硫酸鈉干燥，過濾并通過旋轉蒸發將溶劑從濾液中除去以生成2.1g粗產物。該物質通過在硅膠上的柱色譜純化并用5%的甲醇的乙酸乙酯洗脫以生成(0.24g，0.40mmol，10%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ170.33，170.02，169.17，168.44，155.47，80.78，78.64，70.64，69.81，69.26，68.07，63.01，62.48，55.92，52.57，40.00，38.31，28.10，27.87，20.65。

將乙酰化的產物(0.23g，0.38mmol)在20ml二氯甲烷和5ml TFA的溶液中攪拌，隨后通過旋轉蒸發除去溶劑。將該N-二(羥乙基)甘氨酸殘留物與10ml無水二氯甲烷合并，隨后加入DIEA直至PH大于8.0(～0.2g)。將該N-二(羥乙基)甘氨酸加入到6(4.0g，0.10mmol)的30ml無水二氯甲烷溶液中，并在室溫下攪拌過夜。此時，將溶劑通過旋轉蒸發部分除去，將產物用醚沉淀，并收集并用醚洗滌。將該粗產物從12%DMF/IPA中重結晶以生成(3.8g，0.02mmol，95%)。

13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ170.29，169.97，169.13，168.37，155.90，80.80，70.68-69.67(PEG)，69.20，68.09，63.52，63.02，62.47，55.94，52.59，40.49，38.31，27.91，20.69.

將該PEG化的產物(3.8g，0.10mmol)的40ml二氯甲烷和20mlTFA的溶液在室溫下攪拌15小時，隨后通過旋轉蒸發將溶劑部分除去，用醚將產物沉淀。固體通過過濾收集，并用醚洗滌數次并干燥以生成酸(3.4g，0.08mmol，89%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ170.96，169.93，168.89，168.23，155.78，72.45-66.94(PEG)，63.23，62.38，61.63，54.82，52.47，40.23，38.03，20.39。

將該酸(3.4g，0.08mmole)、2-巰基噻唑啉(59mg，0.50mmol)和DMAP(81mg，0.66mmol)的40ml無水二氯甲烷溶液在冰浴中冷卻至0℃，隨后加入EDC的鹽酸鹽(0.11g，0.59mmol)。將該混合物溫熱至室溫過夜。此時，通過旋轉蒸發將溶劑部分除去，將該產物用醚過濾，并收集并用醚洗滌。將該粗產物從20%DMF/IPA中重結晶以生成15(3.2g，0.078mmol，94%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ200.96，172.64，170.28，168.13，168.34，155.85，75.76-69.15(PEG)，68.07，63.48，63.20，62.62，60.56，55.31，52.53，40.44，38.26，28.74，20.66.

實施例10化合物16的合成將15(3.2g，0.0783mmol)，阿霉素(0.18g，0.319mmol)和DMAP(77mg，0.62mmol)的30ml二氯甲烷和30ml DMF的溶液在室溫下攪拌過夜。此時，通過旋轉蒸發將溶劑部分除去，將產物用醚沉淀，并收集并用醚洗滌。將該粗產物從20%DMF/IPA中重結晶四次以生成16(2.8g，0.067mmol，88%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ212.98，186.21，185.86，170.34，169.33，168.98，168.29，160.32，155.79，155.58，154.94，135.22，134.70，133.23，133.05，120.09，119.14，118.03，110.79，110.61，100.29，75.90-68.44(PEG)，67.80，66.91，64.90，63.31，62.06，61.36，58.79，56.18，53.86，53.60，44.37，40.26，38.12，35.25，33.27，29.33，20.47，16.48。

實施例11化合物17的合成在室溫下向12(1.0g，4.0mmol)的20ml二氯甲烷溶液中加入三氟生(0.4g，1.3mmol)，和二異丙基乙基胺(1.0g，8.1mmol)。將該混合物在室溫下攪拌一小時，隨后加入1(0.88g，4.0mmol)和DMAP(0.5g，4.0mmol)。將該混合物在室溫下攪拌過夜，隨后用0.1N HCl洗滌。將有機層經無水硫酸鈉干燥，過濾，并將溶劑通過旋轉蒸發從濾液中除去以生成2.2g粗產物。將該物質通過在硅膠上的柱色譜純化并用6%的甲醇的乙酸乙酯溶液洗脫以生成17(1.3g，2.6mmol，65%)。

13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ170.86，156.23，155.69，81.10，78.94，62.60，59.03，56.81，56.09，53.17，40.68，40.18，28.28，28.00。

實施例12化合物18的合成向17(0.1g，0.2mmol)的2ml無水二氯甲烷溶液中加入乙酰氯(32mg，0.4mmol)，隨后加入二異丙基乙基胺(87mg，0.67mmol)。將該混合物在室溫下攪拌10分鐘，此時通過TLC檢測不到原料。將該混合物用飽和碳酸氫鈉洗滌并經無水硫酸鈉干燥，過濾，并通過旋轉蒸發將溶劑從濾液中除去以生成18(0.1g，0.2mmol，100%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ170.59，170.33，156.16，155.64，80.99，79.13，70.21，70.05，63.08，62.97，56.48，53.46，52.92，40.87，40.39，28.49，28.27，21.04，20.69。

實施例13化合物20的合成將18(0.1g，0.2mmol)的8ml二氯甲烷和2ml TFA溶液攪拌15分鐘，隨后通過旋轉蒸發將溶劑除去。將N-二(羥乙基)甘氨酸殘余物與5ml無水二氯甲烷合并，隨后加入DMAP直至PH超過8.0(～0.6g)。將該N-二(羥乙基)甘氨酸溶液加入到19(2.0g，0.05mmol)的15ml無水二氯甲烷溶液中，并在室溫下攪拌過夜。此時，通過旋轉蒸發將溶劑部分除去，將產物用醚沉淀，并收集并用醚洗滌。將該粗產物從12%DMF/IPA中重結晶以生成20(1.8g，0.04mmol，90%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ170.50，170.18，156.40，156.37，156.08，155.32，80.74，71.57-65.23(PEG)，63.72，63.29，62.62，58.68，56.10，53.13，52.53，40.93，40.51，27.94，20.74。

實施例14化合物21的合成將20(1.8g，0.04mmol)的20ml二氯甲烷和10ml TFA的溶液在室溫下攪拌7小時，隨后通過旋轉蒸發將溶劑部分除去，并用醚將產品沉淀。通過過濾收集固體，并用醚洗滌數次并干燥以生成(1.4g，0.03mmol，78%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ172.11，170.34，156.39，156.16，155.41，72.80-67.82(PEG)，63.75，63.35，62.30，61.89，58.71，56.15，53.66，53.25，40.93，40.55，20.65。

將該酸(1.2g，0.03mmol)，2-巰基噻唑啉(0.01g，0.09mmol)和DMAP(0.014g，0.12mmol)的10ml無水二氯甲烷溶液在冰浴中冷卻至0℃，隨后加入EDC的鹽酸鹽(0.017g，0.09mmol)。將該混合物溫熱至室溫過夜。此時，將溶劑通過旋轉蒸發部分除去，將該產物用醚沉淀，并收集并用醚洗滌。將該粗產物從12%DMF/IPA中重結晶以生成21(1.1g，0.03mmol，92%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ170.76，170.46，156.33，155.99，155.30，71.54-69.12(PEG)，63.69，63.32，62.84，62.62，60.70，58.67，55.36，53.05，52.49，40.92，40.49，28.78，20.71。

實施例15化合物22的合成將21(1.0g，0.025mmol)，阿霉素(28mg，0.05mmol)和DMAP(12mg，0.1mmol)的10ml二氯甲烷和10ml DMF的溶液在室溫下攪拌過夜。此時，將溶劑通過旋轉蒸發部分除去，將產物用醚沉淀，并收集并用醚洗滌。將該粗產品從12%DMF/IPA中重結晶以生成22(0.6g，0.015mmol，60%)。

實施例16化合物24的合成將23(23g，0.575mmol)和二琥珀酰亞胺基碳酸酯(2.36g，9.2mmol)的230ml二氯甲烷和23ml DMF的溶液冷卻至0℃，隨后加入吡啶(0.75ml，9.2mmol)。將該混合物溫熱至室溫過夜，隨后通過Celite過濾并通過旋轉蒸發器將溶劑從濾液中部分除去。將粗產物用醚沉淀出來并通過過濾收集。從20%DMF/IPA中重結晶，獲得24(20.1g，0.50mmol，86%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ168.15，151.14，70.76-69.67(PEG)，67.99，45.24，25.20。

實施例17化合物25的合成將18(0.51g，0.9mmol)的溶液與10ml無水二氯甲烷合并，隨后加入DIEA直至PH超過8.0(～0.6g)。將該N-二(羥乙基)甘氨酸溶液加入到24(5.0g，0.12mmol)的40ml無水二氯甲烷溶液中，并在室溫下攪拌過夜。此時，通過旋轉蒸發將溶劑部分除去，將該產物用醚沉淀，并收集并用醚洗滌。將該粗產物從12%DMF/IPA中重結晶以生成25(4.9g，0.12mmol，94%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ170.38，170.12，155.90(D)，80.65，72.16-69.20(PEG)，63.51，62.79，62.62，61.28，56.12，53.10，52.53，45.19，40.46，27.91，20.72。

實施例18化合物26的合成將25(5.5g，0.13mmol)的55ml二氯甲烷和28ml TFA的溶液在室溫下攪拌7小時，隨后通過旋轉蒸發部分除去，并用醚將產物沉淀。通過過濾收集固體，并用醚洗滌數次并干燥以獲得酸(5.1g，0.12mmol，93%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ170.49，170.20，156.01，155.68，70.70-69.22(PEG)，67.80，66.68，63.54，62.64，61.65，61.22，55.45，53.57，53.17，45.21，40.52，20.56。

將該酸(5.0g，0.12mmol)，2-巰基噻唑啉(0.17g，1.4mmol)和DMAP(0.23g，1.9mmol)的50ml無水二氯甲烷溶液在冰浴中冷卻至0℃，隨后加入EDC鹽酸鹽(0.28g，1.5mmol)。將該混合物溫熱至室溫過夜。此時，通過旋轉蒸發將溶劑部分除去，將產物用醚沉淀，并收集并用醚洗滌。將該粗產物從12%DMF/IPA中重結晶以獲得26(4.6g，0.11mmol，92%)。13C NMR(75.4MHz，CDCl3)Δ200.88，172.83，170.38，155.91，72.15-69.20(PEG)，63.51，63.03，62.82，62.62，61.26，60.70，55.34，53.07，52.52，45.19，40.47，28.78，20.71。

實施例19化合物27的合成將26(2.3g，0.055mmol)，阿霉素(0.25g，0.44mmol)和DMAP(0.11g，0.88mmol)的20ml二氯甲烷和20ml DMF溶液在室溫下攪拌過夜。此時，通過旋轉蒸發將溶劑部分除去，將產物用醚沉淀，并收集并用醚洗滌。將該粗產物從12%DMF/IPA中重結晶兩次以獲得27(1.7g，0.039mmol，71%)。

實施例20單N-二(羥乙基)甘氨酸-12K-溶菌酶和單N-二(羥乙基)甘氨酸-20K-溶菌酶共軛物的制備在快速攪拌下，將PEG粉末，以PEG對蛋白質為1∶1.5-2的反應摩爾比下加入到6ml在0.05M，PH為7.6的磷酸鈉溶液中的5mg/Ml溶菌酶(Sigma，MO)中。60分鐘后，在反應溫度為25℃和在N2下，將樣品用10mM PH為5.1的磷酸鈉溶液稀釋至導電性低于2ms，PH～5(較低的PH將淬滅反應并穩定可釋放的PEG-蛋白質共軛物)。

將單PEG-溶菌酶在陽離子交換柱(Poros HS，Applied Biosystems，CA)上利用20mM PH為5.1的磷酸鈉溶液體系和1M NaCl的20mMpH為5.1磷酸鈉梯度緩沖液進行分離。從所述柱子上洗脫的化合物的順序顯示為首先多PEG-溶菌酶，然后單PEG-溶菌酶，并且然后是未改變的溶菌酶。在SDS-PAGE(預制的4-20%SDS非還原膠，Invitrogen，CA)上識別的單PEG-溶菌酶的峰利用具有5k NMWL膜(MilliporeCorp.，Bedford，MA)的Ultrafree離心過濾器采集和濃縮。

實施例21多N-二(羥乙基)甘氨酸-12K-溶菌酶和多N-二(羥乙基)甘氨酸-20K-溶菌酶共軛物的制備在快速攪拌下，將PEG粉末，以PEG對蛋白質為1∶20-30的反應摩爾比下加入到0.5ml在0.1M，PH為7.6的磷酸鈉溶液中的5mg/Ml溶菌酶中。在室溫下，在N2下，反應進行60分鐘并通過將PH降低至6.0而停止，或立即在體積排阻柱上純化。

將反應混合物用20mM PH為6.0的磷酸鈉稀釋至5ml，通過0.45μm過濾器過濾，并在HiLoad Superdex 200柱(Amersham，NJ)上分離。將該柱子在140mM NaCl，20mM NaP，PH 6.0中平衡并將所述共軛物在1ml/流分/分鐘下洗脫出。將在SDS-PAGE上識別的峰的級分收集起來并利用Ultrafree 30K(Millipore Corp.，Bedford，MA)濃縮。

實施例22體外結果表1.PEG-N-二(羥乙基)甘氨酸-阿霉素共軛物的性質

實施例23蛋白質共軛物材料和方法雞蛋清溶菌酶(EC 3.2.1.17)，溶菌酶底物細菌(溶壁微球菌(Micrococcus Lysodeikticus))和PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，PH 7.4，138mM NaCl，和2.7mM KCl)購自Sigma Inc.(St.Louis，MO)。預制的Tris甘氨酸SDS電泳凝膠和凝膠電泳運行緩沖液(Gel Runningbuffer)得自Invitrogen(Carlsbad，CA)。用于測量體外共軛物水解的大鼠血漿在EDTA中進行并冷凍保存。IL-2購自PeproTech(Princeton，NJ)，并且GFP得自Clontech(Palo Alto，CA)。所有體內的測量一式三份地進行，并且對于體外測量發現±5%的標準偏差。

單PEG-溶菌酶共軛物的制備得自雞蛋的溶菌酶具有14,500的分子量和6個賴氨酸殘基。在快速攪拌下，將活化的PEG粉末，以1∶1(PEG∶溶菌酶)的反應摩爾比加入到在PH為7.3的0.1M磷酸緩沖液中的5mg/ML的溶菌酶溶液中。在25℃下攪拌45分鐘后，將反應用0.2M磷酸鈉(PH 5.1)處理至終PH為6.5。利用截留范圍6,000-8,000MW濾過膜(Cutoff Membrane)在4℃下在PH 5.1的20mM磷酸鈉中透析反應混合物。透析后所述樣品的導電性應當小于2mS。在陽離子交換柱(Poros，HS)上利用具有NaCl梯度的PH為5.1的20mM磷酸鈉的溶劑體系進行單PEG-溶菌酶的分離。采集單PEG-溶菌酶的峰并利用具有10k NMWL膜(MilliporeCorp.，Bedford，MA)的Ultrafree離心過濾器裝置濃縮。純化的單PEG-溶菌酶的收率為約20-30%。

多PEG-溶菌酶共軛物的制備在快速攪拌下，將活化的PEG接頭，以30∶1(PEG∶溶菌酶)的反應摩爾比加入到在PH為7.3的0.1M磷酸緩沖液中的5mg/ML的溶菌酶溶液中。在室溫下攪拌45分鐘后，將反應用0.2mM磷酸鈉(PH 5.1)處理至最終PH為6.5。將反應混合物用H2O稀釋并在Hiload Superdex200柱上在1mL/Min下分離。該柱子緩沖液包含20mM磷酸鈉(PH 6.8)和140mM NaCl。將所述峰的級分收集起來并利用具有30k NMWL膜(Millipore Corp.，Bedford，MA)的Ultrafree離心過濾器裝置濃縮。純化的多PEG-溶菌酶的收率為約85%，并且每個溶菌酶分子的PEG數量如通過熒光含量測定所分析的那樣發現為5-6。

濃度確定在0.1M，PH為7.3的磷酸鈉中，通過UV利用在280nm處2.39mL/Mg.Cm的消光系數確定PEG-溶菌酶共軛物的濃度。

溶菌酶的酶活性分析在如上所述的反應條件下，在僅與單個PEG結合后，溶菌酶活性消失。所述溶菌酶的釋放通過在多種釋放條件下酶活性的產生表明并在SDS電泳凝膠上證實。

在典型的溶菌酶活性分析中，在96孔滴定板中，將0.2mL的0.02%(W/V)M.Lysode